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序
目次
商品簡介
作為一部以黃酮類化合物為主要研究物件的合成生物學製造的專著，本書結合作者團隊在執行國家973 計劃、863 計劃、國家自然科學基金項目和江蘇省自然科學基金重點項目等的研究實例（博碩士論文），針對微生物法合成黃酮類天然產物過程中的關鍵科學問題，從黃酮類化合物的高效合成代謝途徑發掘及構建、黃酮類化合物生物合成代謝途徑調控原理及應用、代謝網絡調控新方法及其應用等方面，較為系統地闡述了合成生物學方法生產目標產物的關鍵技術優勢。本書內容注重結合理論性和實踐性，突出理論與方法的普適性，體現前沿性和創新性。
本書不僅可以為從事植物天然產物研究的讀者提供參考，也可以為從事代謝工程與合成生物學生產其他產物的讀者提供分析問題和解決問題的思路與方法。
本書不僅可以為從事植物天然產物研究的讀者提供參考，也可以為從事代謝工程與合成生物學生產其他產物的讀者提供分析問題和解決問題的思路與方法。
名人/編輯推薦
1.本書所闡述的黃酮類化合物生物合成的未知基因挖掘及合成代謝途徑構建、合成途徑調控原理及應用、高效分泌系統的研發等章節，對利用合成生物學策略改造微生物生產更為複雜的目標化合物，提供了全新的分析思路及解決方法。
2.本書以多年項目實際實施中的原創理論和經驗為主要闡述點，對於相關專業從事者，無論是初窺門徑者亦或是具有豐富研發經驗的研究人員，均具有較好的啟發和參考價值。
3. 本書內容注重結合理論性和實踐性，突出理論與方法的普適性，體現前沿性和創新性。
2.本書以多年項目實際實施中的原創理論和經驗為主要闡述點，對於相關專業從事者，無論是初窺門徑者亦或是具有豐富研發經驗的研究人員，均具有較好的啟發和參考價值。
3. 本書內容注重結合理論性和實踐性，突出理論與方法的普適性，體現前沿性和創新性。
序
發酵工程是當代工業生物技術的重要領域和組成部分。系統生物學、代謝工程和合成生物學技術的飛速發展，使得人們可以采用更多的策略改造微生物生產更多種類的目標產物，極大地拓展了發酵工程的應用範圍。
黃酮類化合物是一類重要的植物次級代謝產物，廣泛存在於植物的各種組織中，幫助植物抵抗細菌、真菌等侵入，是植物防御系統的重要組成部分。花青素類黃酮類化合物賦予植物花、果實、葉子等以豐富多彩的顏色。黃酮類化合物種類繁多，已經被鑒定的種類超過5000 種，很多具有非常重要的用途。黃酮類化合物具有多種調節人體生理功能的特性，如水飛薊賓和二氫楊梅素等可以緩解肝臟毒性，大豆異黃酮等可以減輕更年期症狀，淫羊藿苷等可以預防中老年骨質疏松症等。由於天然植物中黃酮類化合物的含量普遍較低，導致價格奇高、供應短缺，嚴重限制了很多具有明確功能的黃酮類化合物在食品、醫藥、飼料和化妝品中的廣泛應用。黃酮類化合物由於代謝途徑長、前體來源多，也被很多研究者作為合成生物學研究的一類重要目標產物，建立了很多重要的合成生物學理論與方法。
作者團隊自2010 年開始，在國家973 計劃、863 計劃、國家自然科學基金項目、江蘇省自然科學基金重點項目等的支持下，利用系統生物學方法挖掘水飛薊賓和淫羊藿苷等複雜黃酮類化合物的合成代謝途徑，開發靜態和動態精細調控策略優化黃酮類化合物合成代謝途徑，結合對轉運途徑的分析和發酵過程優化，實現了多種黃酮類化合物的高效合成，形成了4 篇博士學位論文和6 篇碩士學位論文，這些學位論文正是本書的主體。研究工作也得到了美國唐納德植物科學中心（McDonald Danforth Plant Science Center）的Oliver Yu 教授、倫斯勒理工學院（Rensselaer Polytechnic Institute）的Mattheos AG Koffas 教授、得州大學奧斯汀分校（University of Taxas at Austin）的Hal Alper 教授、馬裡蘭大學巴爾的摩分校（University of Maryland at Baltimore County） 的Peng Xu 博士等的大力支持。在本書編寫工作中也大量參考了近年來在國內外學術期刊、行業期刊、相關專著以及互聯網發表的研究論文、綜述文章和市場分析等成果，在此一並致謝。作者以黃酮類化合物為載體，運用了大量最新的生物技術理論與方法，相信本書不僅可以為從事植物天然產物研究的讀者提供參考，也可以為從事代謝工程與合成生物學生產其他產物的讀者提供分析問題和解決問題的思路與方法。
參與本書中部分章節寫作的有：周景文、陳堅、吳俊俊、呂永坤、周勝虎、高松、朱賽杰、王奎、劉沛然、張思琪、李廣健等。作者特別感謝中國工程院院士、江南大學生物工程學院倫世儀教授的鼓勵和指導，感謝所在研究室的老師、博士後、博士和碩士研究生給予的幫助。
作者力圖在本書中注重結合理論性和實踐性，突出理論與方法的普適性，體現前沿性和創新性，但限於作者的學術功底、研究經驗和寫作能力，書中存有疏漏和不妥，若蒙賜教，不勝感激！
作 者
2021 年10 月
黃酮類化合物是一類重要的植物次級代謝產物，廣泛存在於植物的各種組織中，幫助植物抵抗細菌、真菌等侵入，是植物防御系統的重要組成部分。花青素類黃酮類化合物賦予植物花、果實、葉子等以豐富多彩的顏色。黃酮類化合物種類繁多，已經被鑒定的種類超過5000 種，很多具有非常重要的用途。黃酮類化合物具有多種調節人體生理功能的特性，如水飛薊賓和二氫楊梅素等可以緩解肝臟毒性，大豆異黃酮等可以減輕更年期症狀，淫羊藿苷等可以預防中老年骨質疏松症等。由於天然植物中黃酮類化合物的含量普遍較低，導致價格奇高、供應短缺，嚴重限制了很多具有明確功能的黃酮類化合物在食品、醫藥、飼料和化妝品中的廣泛應用。黃酮類化合物由於代謝途徑長、前體來源多，也被很多研究者作為合成生物學研究的一類重要目標產物，建立了很多重要的合成生物學理論與方法。
作者團隊自2010 年開始，在國家973 計劃、863 計劃、國家自然科學基金項目、江蘇省自然科學基金重點項目等的支持下，利用系統生物學方法挖掘水飛薊賓和淫羊藿苷等複雜黃酮類化合物的合成代謝途徑，開發靜態和動態精細調控策略優化黃酮類化合物合成代謝途徑，結合對轉運途徑的分析和發酵過程優化，實現了多種黃酮類化合物的高效合成，形成了4 篇博士學位論文和6 篇碩士學位論文，這些學位論文正是本書的主體。研究工作也得到了美國唐納德植物科學中心（McDonald Danforth Plant Science Center）的Oliver Yu 教授、倫斯勒理工學院（Rensselaer Polytechnic Institute）的Mattheos AG Koffas 教授、得州大學奧斯汀分校（University of Taxas at Austin）的Hal Alper 教授、馬裡蘭大學巴爾的摩分校（University of Maryland at Baltimore County） 的Peng Xu 博士等的大力支持。在本書編寫工作中也大量參考了近年來在國內外學術期刊、行業期刊、相關專著以及互聯網發表的研究論文、綜述文章和市場分析等成果，在此一並致謝。作者以黃酮類化合物為載體，運用了大量最新的生物技術理論與方法，相信本書不僅可以為從事植物天然產物研究的讀者提供參考，也可以為從事代謝工程與合成生物學生產其他產物的讀者提供分析問題和解決問題的思路與方法。
參與本書中部分章節寫作的有：周景文、陳堅、吳俊俊、呂永坤、周勝虎、高松、朱賽杰、王奎、劉沛然、張思琪、李廣健等。作者特別感謝中國工程院院士、江南大學生物工程學院倫世儀教授的鼓勵和指導，感謝所在研究室的老師、博士後、博士和碩士研究生給予的幫助。
作者力圖在本書中注重結合理論性和實踐性，突出理論與方法的普適性，體現前沿性和創新性，但限於作者的學術功底、研究經驗和寫作能力，書中存有疏漏和不妥，若蒙賜教，不勝感激！
作 者
2021 年10 月
目次
第一章 黃酮類化合物簡介 001
1.1 黃酮類化合物 004
1.1.1 黃酮類化合物的基本特性 004
1.1.2 黃酮類化合物的種類 004
1.1.3 黃酮類化合物的功能及市場 007
1.2 黃酮類化合物的生產技術 010
1.2.1 黃酮類化合物提取法生產技術 010
1.2.2 黃酮類化合物化學法合成技術 014
1.2.3 酶催化生物合成黃酮苷 018
1.2.4 黃酮類化合物的微生物法生產技術 022
第二章 黃酮類化合物合成代謝途徑的挖掘與構建 029
2.1 概述 029
2.1.1 黃酮平臺化合物柚皮素和生松素的合成代謝途徑 029
2.1.2 常見的黃酮類化合物修飾途徑 030
2.2 組學技術驅動的水飛薊賓原生合成途徑的解析 032
2.2.1 不同植物組織水飛薊賓及其前體含量差異性分析 034
2.2.2 水飛薊賓合成過程的轉錄組學分析差異基因 036
2.2.3 體外仿生研究及水飛薊賓全合成途徑的解析 041
2.3 黃酮類骨架物質合成途徑的異位重構 047
2.3.1 基於定點突變技術的途徑基因挖掘 048
2.3.2 基於生物信息學分析的途徑基因挖掘 049
2.3.3 基於四質粒共表達體系的合成途徑構建與產物分析鑒定 049
2.4 大腸桿菌生產黃酮類物質聖草酚的研究進展 051
2.4.1 大腸桿菌以L- 酪氨酸為底物生產聖草酚的機理 051
2.4.2 大腸桿菌生產黃酮類化合物聖草酚的國內外研究現狀 052
2.5 代謝工程技術強化大腸桿菌胞內丙二酰輔酶A 的研究進展 053
2.5.1 丙二酰輔酶A 在聖草酚合成中的重要性 053
2.5.2 代謝工程技術強化大腸桿菌胞內丙二酰輔酶A 的研究現狀 053
2.5.3 代謝工程技術強化丙二酰輔酶A 的積累 054
2.5.4 可溶性表達黃酮3' - 羥化酶（F3' H）融合蛋白及平衡相應基因表達 057
2.5.5 重組菌的發酵條件優化與控制 061
2.5.6 優化條件下聖草酚產量與輔酶A 含量 064
2.5.7 基於高效黃酮3' - 羥化酶鑒定的黃杉素合成途徑的挖掘 066
2.5.8 SmF3H 的序列分析 067
2.5.9 SmF3H 的功能鑒定 069
2.5.10 基於啟動子優化SmF3H 表達水平 069
2.5.11 在5L 發酵罐水平進行黃杉素發酵優化 070
2.6 黃杉素從頭合成途徑的構建與優化 072
2.6.1 黃杉素及其微生物法合成 072
2.6.2 微生物法合成黃杉素的現狀與趨勢 072
2.6.3 微生物法高效合成黃杉素意義 078
2.6.4 黃杉素從頭合成途徑在解脂亞洛酵母中的重構 079
2.6.5 黃杉素合成途徑限速步驟分析與模塊化優化 082
2.6.6 通過強化前體代謝流提高黃杉素合成效率 084
2.6.7 發酵條件優化 086
2.7 小結 087
第三章 黃酮類化合物從頭合成代謝途徑的構建 089
3.1 基於高效酶級聯轉化體系的松柏醇全合成途徑的構建 089
3.1.1 過氧化氫對香草醇氧化酶的抑制及松柏醇的過度氧化作用 090
3.1.2 過氧化氫酶的表達與分析 092
3.1.3 強化過氧化氫酶活性的松柏醇酶級聯轉化體系分析 093
3.1.4 體系條件優化及3L 發酵罐發酵 093
3.2 高效水飛薊賓體外合成新途徑構建 096
3.2.1 過氧化物酶的選擇及其催化水飛薊賓合成的功能分析 097
3.2.2 酶級聯的設計與構建 100
3.2.3 血紅素合成過程的強化 102
3.2.4 體外反應條件優化 102
3.3 基於限速分析的柚皮素從頭合成途徑的構建 106
3.3.1 柚皮素從頭合成菌株的構建 107
3.3.2 莽草酸途徑對柚皮素積累的影響 109
3.3.3 外源基因表達強度對柚皮素積累的影響 110
3.3.4 發酵罐水平優化柚皮素積累 110
3.4 益生酵母的對香豆酸合成途徑的構建 111
3.4.1 對香豆酸及其衍生物 111
3.4.2 對香豆酸及其衍生物的生物合成 113
3.4.3 釀酒酵母合成天然產物 119
3.4.4 產對香豆酸釀酒酵母工程菌株的構建 122
3.4.5 釀酒酵母生產對香豆酸合成途徑的優化 126
3.4.6 釀酒酵母生產對香豆酸的發酵優化 131
3.5 基於酵母整合包的黃杉素從頭合成途徑構建 135
3.5.1 構建Ty 表達包 137
3.5.2 Ty 表達包的整合能力驗證 138
3.5.3 單位點Ty 整合菌株生產能力的鑒定 140
3.5.4 丙二酰輔酶A 途徑對柚皮素和黃杉素積累的影響 141
3.5.5 三位點Ty 整合菌株從頭合成黃杉素的能力 142
3.5.6 在5L 發酵罐中從頭合成黃杉素 144
3.6 小結 144
第四章 黃酮類化合物代謝途徑的理性調控策略 147
4.1 概述 147
4.1.1 微生物代謝途徑的傳統調控方法 147
4.1.2 微生物代謝途徑的精細調控策略 148
4.2 基於模塊化代謝途徑關鍵基因上調策略 148
4.2.1 黃酮骨架物質總合成途徑的模塊劃分 148
4.2.2 黃酮骨架物質總合成途徑的瓶頸步驟分析 149
4.2.3 特異模塊的精細劃分改造瓶頸步驟 150
4.2.4 模塊化的單獨優化 151
4.2.5 芳香族氨基酸合成黃酮骨架物質途徑的整合 152
4.3 基於內源啟動子的基因上調策略 154
4.3.1 啟動子-5' - 非轉錄區域（PUTR）文庫篩選與準備 154
4.3.2 PUTR 轉錄特性研究 157
4.3.3 細胞生長不同時期PUTR 蛋白質表達特性研究 158
4.3.4 相同PUTR 熒光蛋白表達與mRNA 轉錄水平對比 159
4.3.5 啟動子工程構建高強度PUTR 161
4.3.6 工程化PUTR 普適性研究 163
4.4 基於反義RNA 的脂肪酸代謝途徑關鍵基因下調策略 164
4.4.1 起始反義RNA 表達系統的構建 165
4.4.2 反義RNA 不同結合區域對抑制效率的影響 166
4.4.3 反義RNA 系統對於胞內脂肪酸含量的影響 168
4.4.4 反義RNA 系統協同抑制fabB 和fabF 基因 168
4.4.5 反義RNA 系統對胞內丙二酰輔酶A 濃度的影響 170
4.4.6 反義RNA 系統對柚皮素產量的影響 171
4.4.7 反義RNA 系統對生松素產量的影響 172
4.5 基於CRISPR/dCas9 的中心代謝途徑關鍵基因下調策略 174
4.5.1 CRISPR 干擾系統的構建 176
4.5.2 利用CRISPR 干擾系統鑒定出與丙二酰輔酶A 合成相關的基因 177
4.5.3 菌體生長和丙二酰輔酶A 合成的協調 178
4.5.4 單個基因抑制對於柚皮素產量的影響 181
4.5.5 多個基因抑制對於柚皮素產量的影響 182
4.5.6 單個或多個基因抑制對於生松素產量的影響 182
4.6 小結 184
第五章 黃酮類化合物合成過程的半理性調控策略 187
5.1 概述 187
5.1.1 黃酮及其中間代謝產物的高效檢測方法 187
5.1.2 微生物高效積累目標產物的高通量篩選策略 187
5.2 定向改造技術驅動的高效對香豆酸合成菌株的構建 188
5.2.1 對香豆酸簡介 188
5.2.2 酪氨酸解氨酶的研究進展 189
5.2.3 定向進化方法概述 191
5.2.4 酪氨酸解氨酶高通量篩選方法的建立 192
5.2.5 隨機突變改造酪氨酸解氨酶 197
5.2.6 突變位點的單一及疊加突變與分析 201
5.3 黃酮類化合物及其中間代謝產物的半理性篩選策略 205
5.3.1 柚皮素、對香豆酸和L- 酪氨酸的紫外- 可見光光波譜學特性 206
5.3.2 柚皮素、對香豆酸和L- 酪氨酸的熒光光譜學特性 206
5.3.3 柚皮素檢測條件優化 208
5.3.4 中間產物干擾性驗證 209
5.3.5 TtgR 對柚皮素濃度響應特性研究 210
5.3.6 基於TtgR 的超高通量篩選方法 211
5.3.7 質粒文庫多樣性驗證 213
5.3.8 柚皮素高產菌株第一輪高通量篩選 216
5.3.9 柚皮素高產菌株迭代高通量篩選 217
5.3.10 柚皮素合成關鍵代謝節點解析 218
5.4 小結 219
第六章 黃酮類化合物生物合成途徑的動態調控策略 221
6.1 概述 221
6.1.1 代謝網絡的動態調控策略 221
6.1.2 生物傳感器及其在代謝網絡調控中的應用 222
6.2 基於CRISPRi 的脂肪酸動態調控黃杉素前體代謝途徑 223
6.2.1 隨機和定點整合方法的構建 224
6.2.2 脂肪酸誘導型啟動子分析 228
6.2.3 sgRNA 單靶點阻遏效果分析 228
6.2.4 多基因組合阻遏效果分析 230
6.2.5 脂肪酸合成動態調控下黃杉素與脂肪酸合成 231
6.3 柚皮素合成過程的動態調控 232
6.3.1 柚皮素響應啟動子結構研究 233
6.3.2 對香豆酸響應啟動子結構研究 235
6.3.3 柚皮素動態調控模塊放大效應 236
6.3.4 脂肪酸代謝途徑優化 238
6.3.5 丙二酰CoA 來源代謝途徑優化 240
6.3.6 雙動態調控系統組合發酵 242
6.3.7 文庫構建與轉化效率檢測 243
6.3.8 高通量篩選柚皮素高產菌株 243
6.4 小結 248
第七章 黃酮類化合物轉運途徑的發掘 251
7.1 概述 251
7.1.1 苯丙素類化合物簡介 251
7.1.2 利用大腸桿菌生產苯丙素類化合物的可行性及限制因素 252
7.2 膜蛋白質組學 254
7.2.1 蛋白質組學簡介 254
7.2.2 蛋白質組學的主要研究技術及技術路線 255
7.2.3 蛋白質組學在大腸桿菌中的應用 258
7.3 大腸桿菌AraE 蛋白對苯丙素類化合物轉運的情況 259
7.3.1 araE 基因過量表達和基因沉默菌株構建及驗證 259
7.3.2 過量表達和沉默araE 基因對大腸桿菌苯丙素類化合物轉運的影響 260
7.4 E .coli BL21（DE3）膜蛋白質組學雙向電泳方法優化 262
7.4.1 不同蛋白質純化方法對雙向電泳結果的影響 262
7.4.2 不同凝膠參數的確定 263
7.5 不同苯丙素類化合物刺激下E.coli BL21（DE3）膜蛋白質組學研究結果 264
7.5.1 不同苯丙素類化合物對E.coli BL21（DE3）膜蛋白表達的影響 264
7.5.2 差異表達蛋白質的鑒定及鑒定結果分析 266
7.5.3 關鍵差異蛋白質的分析及定量PCR 驗證 269
7.6 E.coli BL21（DE3）中鑒定關鍵膜蛋白對苯丙素類化合物耐受性的影響 270
7.6.1 關鍵蛋白質基因過量表達菌株的構建 270
7.6.2 過量表達膜蛋白基因對E.coli BL21（DE3）苯丙素類化合物耐受性的影響 271
7.6.3 關鍵蛋白質基因沉默菌株的構建 274
7.6.4 沉默膜蛋白基因對E.coli BL21（DE3）苯丙素類化合物耐受性的影響 277
7.7 小結 279
第八章 合成生物學製造黃酮類天然產物的工業化展望 281
8.1 化學品綠色製造核心技術——合成生物學 281
8.2 合成生物學與代謝工程育種新方法 281
8.2.1 代謝途徑精細調控策略的深入研發 281
8.2.2 合成生物學在微生物系統定向進化中的應用 283
8.2.3 體外合成生物學的應用 287
8.3 展望 290
參考文獻 292
1.1 黃酮類化合物 004
1.1.1 黃酮類化合物的基本特性 004
1.1.2 黃酮類化合物的種類 004
1.1.3 黃酮類化合物的功能及市場 007
1.2 黃酮類化合物的生產技術 010
1.2.1 黃酮類化合物提取法生產技術 010
1.2.2 黃酮類化合物化學法合成技術 014
1.2.3 酶催化生物合成黃酮苷 018
1.2.4 黃酮類化合物的微生物法生產技術 022
第二章 黃酮類化合物合成代謝途徑的挖掘與構建 029
2.1 概述 029
2.1.1 黃酮平臺化合物柚皮素和生松素的合成代謝途徑 029
2.1.2 常見的黃酮類化合物修飾途徑 030
2.2 組學技術驅動的水飛薊賓原生合成途徑的解析 032
2.2.1 不同植物組織水飛薊賓及其前體含量差異性分析 034
2.2.2 水飛薊賓合成過程的轉錄組學分析差異基因 036
2.2.3 體外仿生研究及水飛薊賓全合成途徑的解析 041
2.3 黃酮類骨架物質合成途徑的異位重構 047
2.3.1 基於定點突變技術的途徑基因挖掘 048
2.3.2 基於生物信息學分析的途徑基因挖掘 049
2.3.3 基於四質粒共表達體系的合成途徑構建與產物分析鑒定 049
2.4 大腸桿菌生產黃酮類物質聖草酚的研究進展 051
2.4.1 大腸桿菌以L- 酪氨酸為底物生產聖草酚的機理 051
2.4.2 大腸桿菌生產黃酮類化合物聖草酚的國內外研究現狀 052
2.5 代謝工程技術強化大腸桿菌胞內丙二酰輔酶A 的研究進展 053
2.5.1 丙二酰輔酶A 在聖草酚合成中的重要性 053
2.5.2 代謝工程技術強化大腸桿菌胞內丙二酰輔酶A 的研究現狀 053
2.5.3 代謝工程技術強化丙二酰輔酶A 的積累 054
2.5.4 可溶性表達黃酮3' - 羥化酶（F3' H）融合蛋白及平衡相應基因表達 057
2.5.5 重組菌的發酵條件優化與控制 061
2.5.6 優化條件下聖草酚產量與輔酶A 含量 064
2.5.7 基於高效黃酮3' - 羥化酶鑒定的黃杉素合成途徑的挖掘 066
2.5.8 SmF3H 的序列分析 067
2.5.9 SmF3H 的功能鑒定 069
2.5.10 基於啟動子優化SmF3H 表達水平 069
2.5.11 在5L 發酵罐水平進行黃杉素發酵優化 070
2.6 黃杉素從頭合成途徑的構建與優化 072
2.6.1 黃杉素及其微生物法合成 072
2.6.2 微生物法合成黃杉素的現狀與趨勢 072
2.6.3 微生物法高效合成黃杉素意義 078
2.6.4 黃杉素從頭合成途徑在解脂亞洛酵母中的重構 079
2.6.5 黃杉素合成途徑限速步驟分析與模塊化優化 082
2.6.6 通過強化前體代謝流提高黃杉素合成效率 084
2.6.7 發酵條件優化 086
2.7 小結 087
第三章 黃酮類化合物從頭合成代謝途徑的構建 089
3.1 基於高效酶級聯轉化體系的松柏醇全合成途徑的構建 089
3.1.1 過氧化氫對香草醇氧化酶的抑制及松柏醇的過度氧化作用 090
3.1.2 過氧化氫酶的表達與分析 092
3.1.3 強化過氧化氫酶活性的松柏醇酶級聯轉化體系分析 093
3.1.4 體系條件優化及3L 發酵罐發酵 093
3.2 高效水飛薊賓體外合成新途徑構建 096
3.2.1 過氧化物酶的選擇及其催化水飛薊賓合成的功能分析 097
3.2.2 酶級聯的設計與構建 100
3.2.3 血紅素合成過程的強化 102
3.2.4 體外反應條件優化 102
3.3 基於限速分析的柚皮素從頭合成途徑的構建 106
3.3.1 柚皮素從頭合成菌株的構建 107
3.3.2 莽草酸途徑對柚皮素積累的影響 109
3.3.3 外源基因表達強度對柚皮素積累的影響 110
3.3.4 發酵罐水平優化柚皮素積累 110
3.4 益生酵母的對香豆酸合成途徑的構建 111
3.4.1 對香豆酸及其衍生物 111
3.4.2 對香豆酸及其衍生物的生物合成 113
3.4.3 釀酒酵母合成天然產物 119
3.4.4 產對香豆酸釀酒酵母工程菌株的構建 122
3.4.5 釀酒酵母生產對香豆酸合成途徑的優化 126
3.4.6 釀酒酵母生產對香豆酸的發酵優化 131
3.5 基於酵母整合包的黃杉素從頭合成途徑構建 135
3.5.1 構建Ty 表達包 137
3.5.2 Ty 表達包的整合能力驗證 138
3.5.3 單位點Ty 整合菌株生產能力的鑒定 140
3.5.4 丙二酰輔酶A 途徑對柚皮素和黃杉素積累的影響 141
3.5.5 三位點Ty 整合菌株從頭合成黃杉素的能力 142
3.5.6 在5L 發酵罐中從頭合成黃杉素 144
3.6 小結 144
第四章 黃酮類化合物代謝途徑的理性調控策略 147
4.1 概述 147
4.1.1 微生物代謝途徑的傳統調控方法 147
4.1.2 微生物代謝途徑的精細調控策略 148
4.2 基於模塊化代謝途徑關鍵基因上調策略 148
4.2.1 黃酮骨架物質總合成途徑的模塊劃分 148
4.2.2 黃酮骨架物質總合成途徑的瓶頸步驟分析 149
4.2.3 特異模塊的精細劃分改造瓶頸步驟 150
4.2.4 模塊化的單獨優化 151
4.2.5 芳香族氨基酸合成黃酮骨架物質途徑的整合 152
4.3 基於內源啟動子的基因上調策略 154
4.3.1 啟動子-5' - 非轉錄區域（PUTR）文庫篩選與準備 154
4.3.2 PUTR 轉錄特性研究 157
4.3.3 細胞生長不同時期PUTR 蛋白質表達特性研究 158
4.3.4 相同PUTR 熒光蛋白表達與mRNA 轉錄水平對比 159
4.3.5 啟動子工程構建高強度PUTR 161
4.3.6 工程化PUTR 普適性研究 163
4.4 基於反義RNA 的脂肪酸代謝途徑關鍵基因下調策略 164
4.4.1 起始反義RNA 表達系統的構建 165
4.4.2 反義RNA 不同結合區域對抑制效率的影響 166
4.4.3 反義RNA 系統對於胞內脂肪酸含量的影響 168
4.4.4 反義RNA 系統協同抑制fabB 和fabF 基因 168
4.4.5 反義RNA 系統對胞內丙二酰輔酶A 濃度的影響 170
4.4.6 反義RNA 系統對柚皮素產量的影響 171
4.4.7 反義RNA 系統對生松素產量的影響 172
4.5 基於CRISPR/dCas9 的中心代謝途徑關鍵基因下調策略 174
4.5.1 CRISPR 干擾系統的構建 176
4.5.2 利用CRISPR 干擾系統鑒定出與丙二酰輔酶A 合成相關的基因 177
4.5.3 菌體生長和丙二酰輔酶A 合成的協調 178
4.5.4 單個基因抑制對於柚皮素產量的影響 181
4.5.5 多個基因抑制對於柚皮素產量的影響 182
4.5.6 單個或多個基因抑制對於生松素產量的影響 182
4.6 小結 184
第五章 黃酮類化合物合成過程的半理性調控策略 187
5.1 概述 187
5.1.1 黃酮及其中間代謝產物的高效檢測方法 187
5.1.2 微生物高效積累目標產物的高通量篩選策略 187
5.2 定向改造技術驅動的高效對香豆酸合成菌株的構建 188
5.2.1 對香豆酸簡介 188
5.2.2 酪氨酸解氨酶的研究進展 189
5.2.3 定向進化方法概述 191
5.2.4 酪氨酸解氨酶高通量篩選方法的建立 192
5.2.5 隨機突變改造酪氨酸解氨酶 197
5.2.6 突變位點的單一及疊加突變與分析 201
5.3 黃酮類化合物及其中間代謝產物的半理性篩選策略 205
5.3.1 柚皮素、對香豆酸和L- 酪氨酸的紫外- 可見光光波譜學特性 206
5.3.2 柚皮素、對香豆酸和L- 酪氨酸的熒光光譜學特性 206
5.3.3 柚皮素檢測條件優化 208
5.3.4 中間產物干擾性驗證 209
5.3.5 TtgR 對柚皮素濃度響應特性研究 210
5.3.6 基於TtgR 的超高通量篩選方法 211
5.3.7 質粒文庫多樣性驗證 213
5.3.8 柚皮素高產菌株第一輪高通量篩選 216
5.3.9 柚皮素高產菌株迭代高通量篩選 217
5.3.10 柚皮素合成關鍵代謝節點解析 218
5.4 小結 219
第六章 黃酮類化合物生物合成途徑的動態調控策略 221
6.1 概述 221
6.1.1 代謝網絡的動態調控策略 221
6.1.2 生物傳感器及其在代謝網絡調控中的應用 222
6.2 基於CRISPRi 的脂肪酸動態調控黃杉素前體代謝途徑 223
6.2.1 隨機和定點整合方法的構建 224
6.2.2 脂肪酸誘導型啟動子分析 228
6.2.3 sgRNA 單靶點阻遏效果分析 228
6.2.4 多基因組合阻遏效果分析 230
6.2.5 脂肪酸合成動態調控下黃杉素與脂肪酸合成 231
6.3 柚皮素合成過程的動態調控 232
6.3.1 柚皮素響應啟動子結構研究 233
6.3.2 對香豆酸響應啟動子結構研究 235
6.3.3 柚皮素動態調控模塊放大效應 236
6.3.4 脂肪酸代謝途徑優化 238
6.3.5 丙二酰CoA 來源代謝途徑優化 240
6.3.6 雙動態調控系統組合發酵 242
6.3.7 文庫構建與轉化效率檢測 243
6.3.8 高通量篩選柚皮素高產菌株 243
6.4 小結 248
第七章 黃酮類化合物轉運途徑的發掘 251
7.1 概述 251
7.1.1 苯丙素類化合物簡介 251
7.1.2 利用大腸桿菌生產苯丙素類化合物的可行性及限制因素 252
7.2 膜蛋白質組學 254
7.2.1 蛋白質組學簡介 254
7.2.2 蛋白質組學的主要研究技術及技術路線 255
7.2.3 蛋白質組學在大腸桿菌中的應用 258
7.3 大腸桿菌AraE 蛋白對苯丙素類化合物轉運的情況 259
7.3.1 araE 基因過量表達和基因沉默菌株構建及驗證 259
7.3.2 過量表達和沉默araE 基因對大腸桿菌苯丙素類化合物轉運的影響 260
7.4 E .coli BL21（DE3）膜蛋白質組學雙向電泳方法優化 262
7.4.1 不同蛋白質純化方法對雙向電泳結果的影響 262
7.4.2 不同凝膠參數的確定 263
7.5 不同苯丙素類化合物刺激下E.coli BL21（DE3）膜蛋白質組學研究結果 264
7.5.1 不同苯丙素類化合物對E.coli BL21（DE3）膜蛋白表達的影響 264
7.5.2 差異表達蛋白質的鑒定及鑒定結果分析 266
7.5.3 關鍵差異蛋白質的分析及定量PCR 驗證 269
7.6 E.coli BL21（DE3）中鑒定關鍵膜蛋白對苯丙素類化合物耐受性的影響 270
7.6.1 關鍵蛋白質基因過量表達菌株的構建 270
7.6.2 過量表達膜蛋白基因對E.coli BL21（DE3）苯丙素類化合物耐受性的影響 271
7.6.3 關鍵蛋白質基因沉默菌株的構建 274
7.6.4 沉默膜蛋白基因對E.coli BL21（DE3）苯丙素類化合物耐受性的影響 277
7.7 小結 279
第八章 合成生物學製造黃酮類天然產物的工業化展望 281
8.1 化學品綠色製造核心技術——合成生物學 281
8.2 合成生物學與代謝工程育種新方法 281
8.2.1 代謝途徑精細調控策略的深入研發 281
8.2.2 合成生物學在微生物系統定向進化中的應用 283
8.2.3 體外合成生物學的應用 287
8.3 展望 290
參考文獻 292
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